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​1.遗传物质:

新冠病毒遗传物质是RNA，所以提取RNA

​2.RNA提取方法:

采用Trizol裂解法

​3.实验流程:

Trizol裂解——氯仿抽提——异丙醇沉淀——乙醇洗涤——凉干——DEPC水溶解

​4.实验步骤:

①采样:

从人体喉咙提取样本☜

②Trizol裂解:

往样本中加入Trizol（主要成分是苯酚）裂解蛋白质，释放出的RNA。

③氯仿抽提:

添加氯仿可以使蛋白质变形沉淀，同时氯仿是有机溶剂，苯酚易溶有机溶剂，而RNA易溶于水不溶于有机溶剂，用离心机离心，除去蛋白质沉淀，取上清液（上清液含有RNA）

④异丙醇沉淀:

吸取上层水相于新的EP​离心管中荧光定量pcr技术查什么，加入等体积异丙醇，再放入离心机中，异丙醇能夺取RNA周围水分使RNA聚集发生沉淀，之后去掉上清液，得到RNA

​⑤乙醇洗涤:

加入75%的乙醇溶液，RNA不溶于乙醇溶液，残留的异丙醇和杂质再可溶于乙醇，放入离心机沉淀RNA。

​⑥凉干:

弃去上清液后，离心管至于室温中2到5分钟待，乙醇挥发干燥。

​⑦DEPC水溶解:

DEPC为焦炭酸二乙酯，它能够破坏RNA酶活性，加入DEPC水溶解后可以的得到纯RNA溶液。

​⑧RNA逆转录成cDNA:

首先加入核酸检测试剂盒中的逆转录酶，Oligo（dT）引物，dNTP，根据碱基A与T，G于C互补配对原则，Oligo（dT）引物与新冠病毒RNA3’端相结合，逆转录酶在此结合处开始沿着5’到3’端合成碱基互补配对的cDNA链。

​⑩PCR扩增:

PCR荧光标记法（荧光探针标记）以cDNA某一高度保守基因序列区域为检测靶标，通过PCR法扩增，使这段靶标数量成指数级式递增，扩增的同时产生强度与靶标数量对应的荧光信号，通过检测荧光信号强度来确定样本中是否含有病毒核酸（即是否确诊为阳性）。

中国疾病预防中心推荐新型新冠病毒的检测靶标为核壳蛋白（N）基因区域，全长99个碱基对荧光定量pcr技术查什么，加入正相引物，反向引物，荧光探针，dNTP（DNA聚合酶）☜

PCR聚合酶链式反应包括高温变性，低温退火，中温延伸。

高温变性阶段:加热至94－98℃，保持20－30s使DNA链打开。

低温退火阶段:温度50－65℃，保持20－40s，此时引物和探针通过碱基互补配对与单链结合，探针的5’端存在一个荧光基团FAM，3’端存在一个猝灭集团TAMRA，当荧光基团和猝灭集团距离很近时（7－10nm），荧光基团发出的荧光会被猝灭基团吸收，所以探针完整存在时荧光基团并不会发出荧光。

中温延伸阶段:加入至75－80℃，保持120秒，聚合酶在此结合处开始沿着5’到3’端合成碱基互补链DNA链。由于DNA聚合酶具有核酸外切酶活性，遭遇到探针时将其从模板上切割下来，使荧光基团和猝灭基团分离，进而产生荧光信号，代表一个子链的产生，继续循环，高温变性，打开双链，低温退火，引物探针结合，中温延伸合成双链，PCR检测仪实时检查记录荧光信号值，

并绘制循环数——荧光信号值扩增曲线，横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光强度，结果分析:以第3到第15个循环的荧光信号强度的标准差的十倍预定为荧光信号阈值，阈值线与扩增曲线的交点对应的横坐标表示表示ct值，没有ct至表示阴性，ct值为＞40阴性，ct值＜37阳性，37到40之间为可疑，建议重复采样检测。

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