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通讯作者单位：北京中医药大学

实验设计

天麻、远志、肉苁蓉、地黄、石菖蒲和姜黄（GPCRAC）常用于治疗AD的中药处方中，例如天麻醒脑胶囊，该胶囊已在中国获得临床使用许可，广泛用于治疗头痛、慢性疼痛、疲劳、失忆和失眠。从这六种中药中提取的几种活性成分已显示出神经保护特性。

实验结果

1. GPCRAC提取物改善东莨菪碱诱导的学习记忆障碍

为了评估 GPCRAC 提取物在体内的神经保护作用，我们建立了东莨菪碱诱导的认知障碍小鼠模型。采用新型物体识别 (NOR) 试验、跳台回避 (SDA) 试验和 Morris 水迷宫 (MWZ) 试验评价 GPCRAC 提取物对东莨菪碱诱导的小鼠学习记忆障碍的神经保护作用（图 1 ）。在 NOR 试验中，东莨菪碱处理组（模型组）与对照组相比，在识别辨识指标方面表现出低水平的特征，而 GPCRAC 提取物的中剂量组和高剂量组显著改善了 AD 小鼠降低的 RI （图 1A ）。通过 SDA 测试，我们检测到 GPCRAC 提取物以剂量依赖性方式显著恢复了东莨菪碱诱导的较短跳台潜伏期（图 1B ），与模型组相比，高剂量组的 GPCRAC 提取物显著减少了小鼠的错误次数（图 1C ）。在 Morris 水迷宫（ MWZ ）测试中， AD 小鼠比对照组表现出学习和记忆障碍，而高剂量组的 GPCRAC 提取物改善了认知障碍，这可以通过在移除平台后的最后一天找到平台位点的逃避潜伏期减少和平台区域的更多穿越次数来证明（图 1D ， E ）。在探索期间，东莨菪碱处理的小鼠停留在目标象限的时间减少（图 1F ）。此外，定位导航测试中记录的逃避潜伏期显示， AD 小鼠到达平台所需的时间（逃避潜伏期）比对照组和 GPCRAC 提取物组长，在第 4 天效果最为显著（图 1G ），表明东莨菪碱暴露后显著的空间学习和记忆障碍。

图1 GPCRAC提取物对东莨菪碱处理小鼠学习和记忆缺陷的改善作用

新物体识别能力中新物体的探索时间百分比（辨识指标RI）（A）；跳台被动回避测试中的延迟和错误次数（B，C）；Morris水迷宫最后一天寻找隐藏平台的逃避潜伏期(D)、穿越次数(E)、目标象限停留时间(F)；定位导航测试中的逃避潜伏期（前四天连续训练）（G）。数据表示为平均值± SE (n = 17)。与对照组相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001；与东莨菪碱处理组相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001。

2. GPCRAC提取物改善东莨菪碱诱导的海马神经元损伤

乙酰胆碱 (Ach) 是第一个被发现的神经递质，在海马记忆功能中起重要作用，并与 AD 的发病机制密切相关。胆碱乙酰转移酶 (ChAT) 是一种合成乙酰胆碱 (Ach) 的酶，被认为存在于脑脊液 (CSF) 和血浆中，而乙酰胆碱酯酶 (AchE) 是一种在突触间隙代谢 Ach 的酶，可导致认知障碍。为了进一步评估 GPCRAC 提取物对海马神经元损伤的神经保护作用，我们评估了由 Ach 含量和 ChAT 活性降低以及 AchE 活性增加所表明的胆碱能功能障碍。如图 2 所示， GPCRAC 提取物显著逆转东莨菪碱处理小鼠海马组织中 Ach 含量减少（图 2A ）、 ChAT 活性降低（图 2B ）以及 AchE 活性增加（图 2C ），尤其是高剂量组，证实了 GPCRAC 提取物在东莨菪碱暴露后对胆碱能功能的改善作用。结合行为实验，我们的研究结果表明，高剂量 GPCRAC 提取物有助于缓解东莨菪碱引起的认知障碍，因此，我们选择高剂量 GPCRAC 提取物进行进一步的机制研究。

图2 GPCRAC提取物对东莨菪碱致认知缺陷小鼠海马胆碱能系统功能障碍的改善作用

根据试剂盒说明书测定海马Ach含量（A）、ChAT活性（B）和AchE活性（C）；数据表示为平均值±SE。与对照组相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p ；与东莨菪碱处理组相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001 (n=3)。

3. 高效液相色谱分析鉴定了GPCRAC提取物的成分

我们在 m/z 120-1800 范围内记录质谱。所有数据均使用 Xcalibur 软件（ 2.7 版）进行处理。在优化的 UHPLC 和 MS 条件下，主要成分得到了很好的分离和检测（图 3 ）。通过将 UPLC-Q-Orbitrap MS 分析与 TCMSP 数据库 () 和参考文献进行比较，我们鉴定了 GPCRAC 提取物的化学成分，采用正负离子模式的分子离子峰分析化合物的相对分子质量；然后通过比较色谱保留时间和 MS/MS 信息对化合物进行定性鉴定。最后，我们从 GPCRAC 提取物中鉴定出 38 种化合物，包括天麻素、 SibiricoseA5 、 3,6'-Disinapolysucrose 、 OnjisaponinB 、松果菊苷、毛蕊花糖苷、姜黄素、 1',2'- 二羟基细辛脑（表 1 ）。

图3 GPCRAC提取物在正(A)和负(B)离子模式下监测的总离子色谱图

GPCRAC提取物成分分析：GPCRAC提取物有天麻素、3, 6'-Disinapoly sucrose、松果菊苷、毛蕊花糖苷、姜黄素等成分（C）。

表1 UHPLC-Q-Orbitrap正负离子模式分析GPCRAC提取物的化学成分

4. 蛋白质组数据的质量评估

我们使用从东莨菪碱诱导的 AD 小鼠获得的海马蛋白质组的三个重复样品进行了高通量定量蛋白质组学，基于非标记定量蛋白质组学的流程图如图 4A 所示。详细地，为了验证 AD 小鼠模型的海马蛋白质组数据是否可以应用于进一步的 AD 研究，我们评估了海马蛋白质组的定量重现性（技术和实验条件的差异）。每个样本的标准化蛋白质表达显示出类似的分布（图 4B ）。此外，我们应用主成分分析 (PCA) 来表征海马样本内和海马样本之间的蛋白质组变化程度。如图 4C 所示，前两个主成分（ PC1 和 PC2 ）占总体累积方差贡献率的 87.9% 。它还显示了对照组和模型组之间明显区分。此外，与模型组相比，来自 GPCRAC 提取物组的不同样品位置更紧凑，表现出优异的重现性。同样，如图 4D 所示，我们发现同一组的生物重复之间存在很强的 Pearson 相关性（ R ， 0.990-1 ），并且不同组之间的相关性显著降低。总之，观察到的定量蛋白表达的变化反映了小鼠组织中不同组间分子变化的多样性，而非由于我们的非标记策略的影响。因此，蛋白质组学分析的工作流程稳定可靠，无标记定量 (LFQ) 技术提供的高定量准确性使我们能够研究 AD 病理发展中的蛋白质组学改变。

图4蛋白质组数据的质量评估

基于LC-MS/MS的蛋白质组学分析的工作流程的图解说明(A)；在每组三个重复样品中检测到的所有差异表达蛋白的Log2比率分布，由基于FDR 的ANOVA确定；从东莨菪碱诱导的AD小鼠(C)中获得的海马蛋白质组的PCA分析。不同组之间的样本相关热图（D）。

5. 差异表达蛋白分析

为了表征蛋白质谱中的差异表达，我们使用偏最小二乘判别分析 (PLS-DA) 模型进一步优化不同组的分离情况 ( 图 5A) 。正交偏最小二乘判别分析 (OPLS-DA) 是一种监督识别方法，用于加强对照组与模型组（图 5B ， R2Y = 0.941 ， Q2 = 0.685 ）和模型与 GPCRAC 之间的区分（图 5C ， R2Y = 0.986 ， Q2 = 0.79 ）。随后，我们使用置换检验来评估 OPLS-DA 模型可能的过拟合。相应的验证图显示，为不同组的重复样本构建的所有 PLS-DA 模型都是有效的（图 5D ， E ）。 OPLS-DA 分类结果显示各组有明显的分离，说明不同组间差异表达蛋白的表达发生显著变化。我们选择 MC/NC 倍数变化 > 1.2 或

图5评估差异表达的蛋白质

不同组样本的PLS-DA得分图（A）；OPLS-DA得分图模型显示对照组与模型(B)组和模型与GPCRAC提取物(C)组之间的明显分离；对应的置换检验(D,E)；倍数变化截止值设置为≥ 1.2或≤0.883，p < 0.05。从每组(F)中鉴定出海马蛋白质组学中上调或下调的蛋白质；差异表达蛋白的维恩图分析（G）。

6. 综合生物信息学分析提示GPCRAC提取物介导的治疗AD的潜在靶点

基于蛋白质组学的综合生物信息学分析，发现 GPCRAC 提取物在 AD 治疗中的关键靶点蛋白。

首先，通过 GO 和 KEGG 分析，我们探究 GPCRAC 提取物介导的 AD 治疗中涉及的差异表达蛋白的潜在功能。基因本体 (GO) 生物学过程分析表明，这些差异表达蛋白主要富集于自噬小体、突触前活性区膜、 ATP 酶激活物活性、突触后电位、突触后组装的正向调控中，这与 AD 的病理学与海马神经元的突触功能呈正相关的事实是一致的 ( 图 6A) 。 KEGG 分析显示相关通路， p < 0.05 （图 6B ）。我们在 KEGG 通路分析中发现了剪接体、 RNA 转运、核糖体、多巴胺能突触、长期抑制、谷氨酸能突触、 GABA 能突触、细胞凋亡和其他高度富集项。我们发现大多数通路在调节海马神经功能方面发挥重要作用，其中多巴胺能突触通路是最佳的辨别神经相关通路，表明多巴胺能通路可能是治疗 AD 靶点富集的必要信号通路。此外，神经元凋亡是 AD 退行性过程中一个众所周知的通路。

图6差异表达蛋白的GO富集和KEGG通路分析

GO分析得出的差异表达蛋白的生物学过程（A）；差异表达蛋白的KEGG信号通路分析，p值设定为。

接下来，为了确定 GPCRAC 提取物在治疗 AD 中介导的核心蛋白靶点，我们构建火山图以检测在对照组与模型（图 7A ）和模型与 GPCRAC 提取物（图 7B ）组之间显著调节的蛋白质。具体来说， PPP2CA (p63330) 、 PRKACA (P05132) 、 PPP3CC (Q80XK0) 、 GSK3β (E9QAQ5) 和 BCL-2 (P10417) 被证实在模型与对照组中的蛋白质谱明显改变，但在 GPCRAC 提取物治疗后显著逆转。为了评价这些与 AD 遗传相关的显著改变的蛋白质的特定变化水平，我们研究了由单个样本与合并样本（称为 “ 标准化蛋白质丰度 ” ）的比率表示的 “ 蛋白质表达水平 ” 。如图 7C 所示， GSK3β 、 PPP2CA 、 PRKACA 、 PPP3CC 和 BCL-2 的表达水平与火山图一致，在 GPCRAC 提取物处理后恢复。在这些关键蛋白中， PPP2CA 和 PRKACA 在 AD 组中下调， GSK3β 、 PPP3CC 和 BCL-2 在 AD 组中上调。之后，我们利用 Pearson 的相关热图来解释核心差异蛋白之间相互作用的 “ 迹象 ” （即激活 - 抑制关系）。相关矩阵数据（图 7D ）显示这些核心调节蛋白之间呈正相关或负相关， PPP3CC 和 PRKACA 与 BCL-2 呈正相关，而 PPP2CA 和 GSK3β 呈负相关。

图7关键显著调节蛋白质的映射

火山图显示了对照组与模型(A)组和模型与GPCRAC提取物(B)组之间显著改变的蛋白质分布；五种蛋白质（PPP2CA、GSK3β、PPP3CC、PRKACA和BCL-2）被鉴定为AD小鼠海马关键差异表达蛋白。蛋白质的强度作为归一化的蛋白质丰度给出。箱形图(C)中显示了五种蛋白质的显著变化水平；关键差异表达蛋白的相关系数热图（D）。

接下来，我们试图进一步证明核心网络中关键蛋白的生物学解释。简而言之，我们使用 Cytoscape 的 Cytohubba 插件进行蛋白质 - 蛋白质相互作用 (PPI) 网络来表征核心网络内的关键蛋白质变化。前 35 个节点首先使用最大团中心性 (MCC) 方法进行排名。关键蛋白及其生物学功能最终被发现。 PPI 可视化结果表明，几种改变的蛋白质相互之间存在显著联系（富集值 p < 0.005 ），并且大多数关键差异蛋白主要集中在多巴胺能突触和细胞凋亡信号通路中，此外，这些途径和一些已确定的核心蛋白与 AD 发病机制有关（图 8 ）。我们最终选择与多巴胺能突触相关的 PP2CA 、 PRKACA 、 PPP3CC 、 GSK3β 和 BCL-2 作为进一步的分析目标，因为它们与神经元损伤密切相关。

图8构建网络模型以阐明核心网络中关键蛋白的生物学解释

构建了对照组和模型组之间135种蛋白质的功能性蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。MCC排名前35的节点。节点填充颜色条表示上调（红色）或下调（绿色）。节点文本颜色条代表p值。

7. 蛋白质靶标的验证

我们通过蛋白质印迹和 qPCR 进一步验证了 GPCRAC 提取物在介导 AD 中的关键差异表达蛋白和途径。 PPP2CA 编码丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶 2A (PP2A) 催化亚基的 α (α)- 亚型。 PP2A 和 GSK3β 是参与多巴胺能突触通路中突触可塑性调节的必需蛋白，它们与 AD 中的异常 tau 磷酸化和神经元死亡有关。此外， PPP3CC 和 PRKACA 也是突触和神经可塑性的重要调节剂，图 9 说明了这一点。代表性蛋白质印迹图像（图 9A-E ）和 PPP2CA 、 P-PKA 、 PPP3CC 、 P-GSK3β 、 BCL-2 和 Bax 的相对光密度值的倍数变化通过蛋白质印迹测定。在暴露于东莨菪碱的小鼠海马中，与对照组相比， PPP2CA 、 P-PKA 、 PPP3CC 的表达减少（图 9F 、 G 、 J ），和 P-GSK3β 表达过度激活（图 9I ）（ p = 0.005 ）。高剂量的 GPCRAC 提取物导致 PPP2CA 、 PPP3CC 、 P-PKA 和 P-GSK3β 的表达水平发生相当大的逆转。我们还发现东莨菪碱处理的模型小鼠相对于对照组，其 PPP2CA 和 PPP3CC 的 mRNA 表达水平较低（图 9L ， N ）， GPCRAC 提取物处理后恢复。

图9 RT-qPCR和WB验证了显著变化的蛋白质

通过蛋白质印迹分别测量小鼠海马组织中PPP2CA、GSK3β、PRKACA、PPP3CC、BCL-2、Bax的代表性图像(A-E)和蛋白质水平(n = 3) (F-K)；real time-PCR分别检测海马组织中PPP2CA、PPP3CC和Caspase-3的mRNA相对表达量（n=3）（L-N）；数据表示为平均值±SE，与对照组相比，*p < 0.05、**p < 0.01和***p < 0.001；与东莨菪碱治疗组相比，#p < 0.05、##p < 0.01和###p < 0.001 (n= 3)。

细胞凋亡信号系统是动物生长和组织稳态的重要途径。我们使用蛋白质组学发现了凋亡相关蛋白 BCL-2 的明显改变，因此我们想了解更多关于东莨菪碱处理小鼠海马细胞凋亡水平和 GPCRAC 提取物的保护作用的信息。此外， qPCR 和蛋白质印迹用于研究 GPCRAC 提取物在东莨菪碱处理的小鼠海马中的抗凋亡功效。与对照动物相比， Bax 蛋白表达水平（图 9K ）和 Caspase-3 基因表达水平（图 9M ）明显较高， BCL-2 蛋白水平较低（图 9H ）。在小鼠大脑中， GPCRAC 提取物处理可显著降低 Bax 和 Caspase-3 的表达，同时增加 BCL-2 的表达。这些发现表明， GPCRAC 提取物可显著调节东莨菪碱诱导的小鼠脑组织中多巴胺能突触相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达，从而治疗 AD 。

图10 GPCRAC提取物对AD的多巴胺能突触信号通路的调控

由GPCRAC提取物介导的核心差异表达蛋白以红色（上调）和绿色（下调）着色。

使用中药作为 AD 的潜在治疗方法是一个不断发展的研究领域。然而，目前中药治疗缺乏有力的实验证据和机制阐述。一些更有效的疗法也正在被开发。在这项工作中，我们首先研究了 GPCRAC 提取物在减少东莨菪碱诱发的认知障碍方面的神经保护作用。东莨菪碱是一种毒蕈碱胆碱能受体拮抗剂，经常被用作在动物中产生认知障碍的经典药理学模型。据报道，东莨菪碱活性主要与大脑中的胆碱能耗竭和细胞凋亡有关，这两者都是该疾病的标志。基于东莨菪碱诱导的认知障碍，我们研究了 AD 模型小鼠的行为表型，发现高剂量的 GPCRAC 提取物显著缓解 AD 相关的胆碱能功能障碍mrna差异显示技术，表现为 Ach 含量和 ChAT 活性增加以及 AchE 活性降低。此外，行为测试表明，东莨菪碱触发的小鼠海马体在空间学习和记忆能力方面表现出认知功能障碍。除了研究 GPCRAC 提取物在改善认知障碍方面的保护功效外mrna差异显示技术，之前我们还进行了急性口服毒性和 13 周亚急性毒性研究。临床观察、体重、血液学、组织病理学检查、眼科检查等安全性评价均未见不良变化。结合之前的结果，目前的研究证明 GPCRAC 提取物的给药既有效又安全。

目前，虽然已有多个信号通路在 AD 治疗中发挥显著作用，但中药对 AD 病理过程中潜在信号通路的调节作用仍有待研究。天然草药由于其成分复杂，尤其是化合物，通常更难在特定途径中得到阐明。为了进一步了解 GPCRAC 提取物缓解 AD 的作用机制，我们采用深入的定量蛋白质组学来表征从东莨菪碱诱导的 AD 小鼠获得的海马蛋白质组的异常变化。我们基于 MS 的策略确定了不同组共同的 390 种蛋白质。通过映射显著调控的蛋白质图谱，我们确定了五种关键蛋白： PPP2CA 、 GSK3β 、 PPP3CC 、 PRKACA 、 BCL-2 。显著改变的蛋白分别在多巴胺能突触信号通路和凋亡信号通路中富集。因此，这些关键蛋白和相关通路或许作为治疗 AD 的可能机制。

作为 AD 重要的信号转导通路之一，多巴胺能突触信号通路在神经递质协调、记忆巩固、神经元突触功能等过程中发挥着重要的生物学作用。蛋白磷酸酶 2A (PP2A) 在大脑中浓度较高，是一种至关重要的磷酸酶。且 PP2A 上调与 tau 过度磷酸化和淀粉样蛋白形成的减少有关，最近的证据表明， PP2A 介导的蛋白质去磷酸化对于突触可塑性的稳态很重要。 GSK3β 是一种激酶，在 AD 的病因中发挥作用，它在被上游蛋白质如 PP2A 去磷酸化 (p-GSK3β) 后发挥生物学功能。此外， GSK3β 可以通过调节 D2 受体 (D2R) 介导的信号传导来改善多巴胺依赖性记忆行为，被推测为 AD 的潜在治疗靶点，这支持了其与多巴胺能突触途径的关联。此外， GSK3β 和 PP2A 之间的相互作用已经确立，即主要磷酸酶 PP2A 可以通过去除丝氨酸 9 位的磷酸化来调节 GSK3β 的活性。我们的蛋白质组学研究进一步佐证了 PP2A 和 GSK3β 之间存在负相关关系，这对于基础突触传递和长期记忆功能都至关重要。与蛋白质组学结果一致，我们的体内实验证实模型组海马 PP2A 表达减少，磷酸化 GSK3β （ p-GSK3β ）增加，这进一步支持 PP2A 和 GSK3β 平衡的假设，即协调突触可塑性功能，可能是 AD 治疗的重要分子机制。

此外， cAMP 介导的蛋白激酶 A (PKA ，对应于基因符号 PRKACA) 的激活是多巴胺能突触通路的经典下游靶点，在突触前长期可塑性的激活过程中起着至关重要的作用。根据我们蛋白质组学和蛋白质印迹分析的发现，磷酸化 PKA (P-PKA) 可能是 GPCRAC 提取物治疗 AD 的关键靶点。此外，丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶 (PPP3CC) 编码钙调神经磷酸酶 (CaN ；也称为蛋白磷酸酶 2B ， PP2B) 的催化亚基，也是我们筛选的差异表达蛋白中涉及的新指标。结果表明，钙调神经磷酸酶可以通过间接影响对神经元通讯至关重要的 NMDAR 来调节谷氨酸传递，而 NMDAR 的增加可能与 PPP3CC 水平的增加有关。根据我们的蛋白质组学研究结果，模型组中 PPP3CC 蛋白表达上调。然而，利用蛋白质印迹和 qPCR 验证，在 AD 小鼠海马中发现 PPP3CC 蛋白和基因表达水平下降，这与 Eastwood 等人的早期发现相当。他们还发现，在体内病理条件下，海马神经元中 PPP3CCmRNA 的表达水平较低，这表明这种表达的降低可能导致突触可塑性衰竭。我们的发现增加了 PPP3CC 水平随着 AD 的病理进展而降低的证据，并强调了 PPP3CC 可能作为 AD 的新型蛋白质生物标志物的重要作用。然而， PPP3CC 在 AD 中的作用之前尚未被完全描述，其预防神经损伤的机制需要进一步研究。总体而言， GPCRAC 提取物可通过调节多巴胺能突触信号通路来缓解认知障碍（图 10 ）。

除了多巴胺能突触通路相关蛋白外，凋亡通路相关蛋白 BCL-2 显示出显著改变的特征。研究表明多巴胺缺乏介导的神经细胞凋亡是神经退行性疾病的重要病理基础，有人提出胆碱能缺陷引起的神经元凋亡可能是东莨菪碱诱导的认知能力下降的主要原因之一。细胞存活或死亡级联可以通过增加抗凋亡蛋白 BCL-2 来启动。此处变化数据表明，东莨菪碱处理组中 BCL-2 表达显著上调，这与蛋白质印迹的结果相矛盾。这种矛盾的发现可能归因于样本和处理的差异。此外， GPCRAC 提取物处理后， Bax 和 capease3 浓度也有很大的正向差异。综上所述，上述结果支持 GPCRAC 提取物对 AD 的神经保护作用可能是通过生物信息学分析推断出的多巴胺能突触级联和凋亡通路。

结论

总的来说，我们的工作为 AD 病理过程中突触可塑性改变的分子机制提供了新的见解，并进一步证实了 GPCRAC 提取物作为一种天然草药方剂改善进行性 AD 的有效性。然而，由 GPCRAC 提取物介导的详细分子机制主要是未知的，值得进一步研究。总之，我们的研究结果表明， GPCRAC 提取物治疗可以有效缓解东莨菪碱引起的认知障碍。潜在机制可能与多巴胺能突触 / 凋亡通路的调节有关。

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