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文章来源：许艺红,肖义军.猪作为人类器官移植供体的研究进展[J]. 生物学通报, 2022, 57(11): 1-4.

猪作为人类器官移植供体的研究进展

许艺红 肖义军

福建师范大学生命科学学院

摘要

利用猪器官作为人类移植器官的来源是解决当前人源器官严重短缺的途径，但需要解决免疫排斥反应、病毒感染和凝血功能障碍等问题，通过基因技术对猪细胞内的相关基因进行改造，在一定程度上能有效降低病毒感染风险和减轻排斥反应。本文介绍了猪作为人类器官来源的优势及其面临的问题，以及异种器官移植的研究实例。

关键词

异种器官移植 免疫排斥 基因技术

随着现代医学技术的发展，器官移植技术也越来越成熟，器官移植为终末期器官衰竭的治疗带来了曙光，但目前面临的核心问题是器官供体的严重不足，例如我国每年约有150万人因终末期器官衰竭需要移植，但仅有约1万人能够得到移植。干细胞技术为解决这一问题提供了希望，但要使干细胞定向分化发育为某一特定器官，这有相当长的一段路要走。异种器官移植可能是解决这一问题的另一条途径。由于猪的器官大小与人类基本相似，人们很自然地想到把猪的器官作为人类器官的替代来源。随着基因技术和体细胞克隆技术的发展，以及新型免疫抑制剂的开发，这一设想正逐步走向可能。

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猪作为器官移植供体的优势

1905年 ，一 名法国医生尝试将兔肾植入人体，由此揭开异种移植研究的序幕。之后较长一段时间里，科学家将目光聚焦于狒狒、猩猩等非人灵长类动物，进行了心、肝、肾等器官的移植，但移植后器官与受体适配性差，移植物工作时间无法有效延长，受体的存活质量也未见明显改善，实验几乎都以失败告终。2003年，敲除 α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose, Gal）抗原的转基因猪（α-1,3-galactosyltransferase gene knockout，GTKO）问世，猪展现出了作为移植供体的巨大应用前景，异种器官移植迈向了快速发展的全新时代。

相比于其他动物，猪作为人类器官移植供体有许多优势：1）生理学、解剖学结构、代谢过程等许多方面都与人类相似；2）来源广、产仔多、繁殖周期短、生长周期长；3）与人亲缘关系远，传染疾病的概率低（猩猩、狒狒等动物与人类亲缘关系较近，进化相似度高，种间交叉感染的风险更大）；4）遗传背景较清楚，便于进行基因改造。随着锌指核酸酶（zinc-finger nuclease，ZFN）技术、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activatorlike effector nuclease，TALEN）技术、规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR 关联基因（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPRassociated，CRISPR/Cas）技术等基因编辑技术的发展，对猪的基因编辑越来越多样化，使得移植排斥反应大大减轻，提高了供受体间的适配性；5）涉及的伦理问题少。因此，猪被认为是人类异种器官移植的良好供体。当然，由于人类和猪在进化上的巨大差异，直接进行器官移植会产生强烈的免疫排斥反应，导致异种器官移植失败。理论上，通过基因技术对猪的相关基因进行人源化改造以降低其免疫原性，降低或消除移植后免疫排斥反应的发生，就可以达到异种器官移植的要求。

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猪作为异种器官来源面临的问题

猪作为理想的人类器官供源在移植学界已趋于共识，但需要解决病毒感染、免疫排斥反应以及凝血功能异常等问题。近些年来，这些问题正在逐渐得到解决。

2.1病毒感染

猪体内存在诸多病毒，这些病毒不仅会使猪本身致病，也会带来器官移植受体感染病毒的风险。通过无菌环境饲养、筛选供体的方法可以避免戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）、巨细胞病毒（porcine cytomegalovirus，PCMV）、淋巴性疱疹病毒（porcine lymphotropic herpesviruses，PLHVs）等病原体感染受体。猪内源性逆转录病毒（porcine endogenous retroviruses，PERVs）是在猪基因组中存在着多个可遗传拷贝、对人体具有较高风险的RNA病毒，通过上述传统措施无法排除。PERVs 感染人源细胞后，遗传物质可插入人体细胞的基因组中，造成人体细胞基因结构的破坏，最终导致免疫缺陷和肿瘤 。

消除 PERVs 的跨物种感染风险，是进行异种器官移植必须考虑的问题。RNA干扰技术可抑制基因表达，有效降低PERV含量，但无法彻底消除 PERV。通过基因编辑技术敲除相关拷贝，可从根本上控制 PERV 所带来的移植风险。2015年体细胞核移植技术存在的问题，Yang等利用 CRISPR/Cas9 技术一次性敲除猪肾细胞中的62 个 PERVs 拷贝，结果发现 PERVs 的感染能力下降了1000 倍以上；2017年，Niu 等结合 CRISPR/Cas9 技术与体细胞核移植技术获得了世界上第一批37 头 PERVs 失活的克隆猪，其组织和器官在后期生长发育过程中也没有被 PERVs重新感染。实验表明，通过基因技术敲除猪体内PERVs 基因可以降低感染风险，目前器官移植研究的供体猪几乎都已敲除 PERV，但由于基因修饰的猪器官还未被植入人体，人体细胞受感染的潜在风险还需进一步临床验证。

2.2免疫排斥

相较于同种器官移植，异种器官移植的免疫排斥反应更为复杂。按照移植后免疫排斥反应发生的先后顺序，可将异种器官移植排斥反应分为超急性排斥反应（hyperacute rejection，HAR）、急性血管排斥反应（acute vascular re‐jection，AVR）、急性细胞性排斥反应（acute cellularrejection，ACR）和慢性排斥反应（chronic rejection，CR），通过基因编辑敲除特定抗原基因、转入人源化基因可有效抑制移植排斥反应的发生。

2.2.1 超急性排斥反应（HAR）

超急性排斥反应在免疫排斥中反应最快、破坏力最大，一般发生在受体血管与移植体接通后数分钟至24 h 内。该反应的发生与人体内天然抗体与猪血管内皮细胞表面抗原的结合相关，并通过启动补体介导的免疫损伤，破坏移植器官功能。敲除猪血管内皮细胞表面特定的抗原基因、转入人源化基因调节补体系统功能均是减轻超急性免疫排斥反应的有效措施。

α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，Gal）是一种位于猪血管内皮细胞表面的抗原，是在 α-1,3-半乳糖基转移酶（α-1,3-galactosyl transferase，GGTA1）的催化下合成的，存在于除人类及类人猿外所有的哺乳动物红细胞上，能被人体内的天然抗体识别，从而引起对异种器官的免疫攻击。研究发现，当该抗原基因被敲除后，超急性排斥反应的发生率明显下降。补体系统（complement system）在超急性排斥反应当中也发挥着重要作用。人类细胞膜的表面有补体调节蛋白（complement regulatory proteins，CRPs）的表达体细胞核移植技术存在的问题，如衰变加速因子（decay-accelerating factor，DAF）和辅膜蛋白（brancecofactor protein，MCP），可以抑制补体系统的激活。尽管猪细胞的表面也表达一定量的补体调节蛋白，但是还不足以提供与人补体调节蛋白程度相当的保护效应。研究表明，采用在猪血管内皮细胞表面表达的人源化补体调节蛋白 MCP 和 DAF来抑制受体的补体系统激活，可以有效克服超急性排斥反应。并且，在 GGTA1 敲除的基础上转入补体调节蛋白基因比单独敲除 GGTA1 能使得移植物在受体体内存活时间更长。近期，有学者将多基因编辑供体猪（敲除 PERV 及 GGTA1 等3 种抗原基因、转入抑制补体活化等9 种人源化基因）的心、肝、肾分别移植入恒河猴体内，结果显示超急性排斥反应得到有效抑制。

2.2.2 急性血管排斥反应（AVR）

急性血管排斥反应（acute vascular rejection，AVR），也称为急性体液性异种移植排斥反应（acute humoral xenograft rejection，AHXR），一般会在移植后的几天或数周内发生，是猪-人类异种移植器官长期存活的主要障碍。该反应是人体细胞内天然抗体和补体系统介导的延迟性排斥反应，引发吞噬细胞、自然杀伤细胞等先天性免疫细胞对移植物的浸润，摧毁移植器官。避免发生此类排斥反应可考虑从调节先天性免疫细胞的活性入手。

在急性血管排斥反应中，受体体内的巨噬细胞扮演着重要角色。巨噬细胞参与细胞毒性 T 细胞的激活，并通过分泌肿瘤坏死因子、白细胞介素-1 等一系列炎症因子促进移植器官的损伤。因此抑制巨噬细胞活性是降低急性血管排斥反应的方法之一。CD47-SIRPα 信号通路是抵抗巨噬细胞所介导的异种移植排斥的重要途径，信号调节蛋白 α（signal regulatory protein α，SIRPα）是一种表达在巨噬细胞膜上的免疫抑制受体，整联素关联蛋白（cluster of differentiation-47，CD47）是SIRPα 的配体，二者的结合能抑制巨噬细胞的活性。实验证明，表达人 CD47 的猪细胞可以抵抗巨噬细胞的吞噬作用，有效降低急性血管排斥反应，同时不影响猪器官功能。

2.2.3 急性细胞性排斥反应（ACR）

急性细胞性排斥反应（acute cellular rejection，ACR）是指在异种器官移植后，由细胞介导的免疫应答。ACR 主要由 T 细胞介导，当 T 细胞识别异种抗原后，被激活分化为细胞毒性T细胞（cytotoxic lymphocyte，CTL），可以直接破坏靶细胞。CTL 损害移植器官的发生机制是 CTL 表面的 FasL 分子可以与靶细胞表面的 Fas 分子互相识别，通过 Fas 激发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性死亡。利用基因编辑技术修饰猪细胞表面的 Fas 分子，干扰凋亡途径，可以抵抗细胞毒作用 。目前针对抵抗急性细胞性排斥反应的研究主要集中在阻断细胞毒性 T 细胞活化和诱导调节型 T 细胞等方面。

2.2.4 慢性排斥反应（CR）

慢性排斥反应一般会在器官移植后的数月至数年后发生，该反应的组织病理学和同种异体移植相似。目前关于慢性排斥反应机制的报道很少，但比较明确的是由长期低强度的免疫反应所诱发的移植物凝血障碍与该反应有关。如何通过降低慢性排斥反应来改善移植器官的预后，还有待更加深入的研究。

截至2017年，研究者们发现能引起或有效调节免疫学不相容的基因有 29 个之多，其中 21 个需要插入的外源基因，8 个需要突变或敲除的内源基因。越来越多的相关基因正在被确认，但目前的研究还无法反映不同的基因组合对异种器官移植的效果有何差异，以及哪种基因组合对哪种器官移植效果最好。

2.3凝血功能障碍

猪-藏酋猴间的异种肝移植实验表明，受体中组织因子（tissue factor，TF）的异常激活是触发凝血功能障碍的关键因素。猪和人类的凝血及血栓调控因子有着较大的差异，猪和人组织因子途径抑制剂（tissue factor pathwayinhibitor，TFPI）并不相容，猪 TFPI 无法有效抑制人凝血酶的形成，猪凝血调节蛋白（thrombomodulin，THBD）也无法与人凝血酶结合，造成了血栓调控失衡，异种移植后移植器官可能发生受体全身消耗性凝血障碍或血栓性微血管病。研究发现，在猪细胞中表达人的抗凝基因或人血栓调节蛋白，器官移植后可以抑制血小板聚集，显著增加移植物的存活时间。异种移植过程中输注人凝血酶原复合物可促进生成凝血因子，改善移植后大量出血的状况。“13 基因编辑猪”的移植实验表明，转入人源化 TFPI 等凝血调节基因在改善凝血功能障碍方面也具有一定优势。尽管近些年来相关研究较多，但是至今异种移植后引起凝血功能异常的具体机制尚未明确。

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异种器官移植的研究实例

目前，大多数研究者采用非人灵长类动物来进行异种器官移植实验。在猪-非人灵长类动物之间主要进行了肝脏、肾、心脏、小肠等器官的移植实验，其存活时间从几天到几个月甚至几年，不同器官存活时间不同，其中移植存活时间最长的是心脏。

3.1肝脏移植

将未经基因修饰的猪肝移植给非人灵长类动物，猪肝的存活时间一般不会超过12 h。美国匹兹堡大学医学中心于2010年首次进行了 GGTA1 基因敲除猪－狒狒异种肝移植的报道，存活时间为 4~7 d，通过对移植肝的解毒功能、凝血参数以及补体活性进行测定，证明移植肝能够正常发挥功能，狒狒最终因为致命性血小板减少引发的严重自发性出血而死亡。研究证明，GGTA1 基因敲除猪供肝移植能有效延长移植物存活时间，而影响移植物存活的主要因素是非Gal 抗体激活内皮细胞损伤所触发的血小板减少，导致微血管病变及凝血功能紊乱。

3.2肾脏移植

Yamada 等将 GGTA1 基因敲除猪的肾脏移植给狒狒，联合免疫耐受方法，使移植物存活期达到了 83 d，但移植受体均出现高蛋白尿等并发症，导致受体死亡。2015年， Iwase 研究组报道了表达人 CD46/CD55/CD39 等补体调节蛋白的 GGTA1 基因敲除猪供肾移植入狒狒体内后，存活了 136 d，并且极大降低了高蛋白尿并发症发生的概率，而导致受体死亡的主要原因是肾移植后受体的凝血功能紊乱以及慢性排斥反应的发生。2021年，Montgomery 团队将敲除 αGal 抗原等“10 基因编辑猪”的肾脏连接至一名脑死亡患者的血管上，进行了 54 h 的试验观测，相关指标显示，在此期间内该肾脏能够正常工作，且未引发超急性免疫排斥反应。猪肾在脑死亡患者中的试验，意味着异种器官移植向临床转化迈上了一个新台阶，但移植物在人体内究竟会带来哪些影响、反应如何，这些问题的解答还有待更深入的研究。

3.3心脏移植

“2016年，Mohiuddin等利用 hCD46/GGTA1/hTBM3 基因修饰供体猪，将修饰后的猪心脏移植到狒狒体内，并使用抗胸腺细胞诱导球蛋白等免疫调节药物维持治疗，存活最短为159 h，最长达到 945 h。病理学检查结果证明，移植物心脏表现为血栓性微血管病变；心肌表现为缺血及纤维化，伴有局灶性间质出血。

基因技术和免疫调节药物的应用大大延长了异种心脏移植物的存活时间，但大多研究显示，清除 Gal 抗原后还会伴随有多种并发症出现，无法保证移植物的长期存活。这可能是由于 B 细胞活化产生的某些抗体能与移植物中存在的非 Gal抗原相结合，引发慢性排斥反应。因此，寻找导致免疫排斥反应的非 Gal 抗原也是突破异种器官移植的重要途径。

从目前的研究来看，采用猪作为人类器官异种移植的供体来源可能还有一段较长的路要走，需要积累猪-非人灵长类动物之间动物实验的大量数据后才能最终过渡到猪-人实验。目前经过基因技术改造后的猪器官尚未植入人体，还无法评估猪器官异种移植治疗的安全性和有效性。但猪作为人类移植器官来源的相关研究为异种器官移植提供了极大的可能性，为打破人类器官移植资源匮乏的现状带来了曙光。