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基因治疗（gene therapy）是通过操作遗传物质来干预疾病的发生、发展和进程，包括替代或纠正自身基因结构或功能上的错乱等。它可治愈一些现有的常规疗法不能解决的疾病，不仅在疾病治疗方面，而且在疾病预防方面也有重要作用。

目前，利用基因编辑技术已在多种疾病中得到应用，如单基因遗传病、眼科疾病、艾滋病及肿瘤等的基因治疗。

此外，除在遗传性疾病的治疗外，在非遗传性疾病中也有重大突破，如与年龄相关的黄斑衰退（AMD）。

▲世界各国基因编辑临床试验项目数

全世界对基因治疗的研究如火如荼，而基因治疗的发展势必离不开基因编辑技术的发展。

早期的基因编辑技术包括：

① 归巢内切酶（homing endonuclease，HEs）

② 锌指核酸酶技术（Zinc finger nuclease，ZFN）

③ 转录活化因子样效应蛋白技术（transcription activator-like effector，TALE）

但由于脱靶效应和组装复杂性限制了这些技术在基因编辑领域的应用。

近年来，随着基因编辑技术的不断更新，CRISPR-Cas基因编辑及单碱基编辑技术（BE）飞速发展，基因编辑的准确性不断提升，为基因治疗提供了越来越精确的编辑工具。

▲基因编辑技术的发展和应用

基因编辑技术是对生物体DNA断裂现象及其修复机制的应用。在分裂活跃的哺乳动物细胞中，DNA双链断裂（DNA dloble-strand breaks，DSBs）每天都会发生。DNA双链断裂后，细胞会通过多种方式进行修复，包括经典的非同源末端修复（NHEJ）、选择性末端修复（a-EJ），单链退火修复（SSA）和同源重组修复（HR）。NHEJ是将没有同源性的两个DNA末端直接连接进行修复，该过程会发生若干核苷酸的缺失，是一种不精确的修复机制；HR可以精确无误的对DSBs进行修复，但需要同源模板的存在；a-EJ和SSA是辅助性的修复机制，它们会将末端单链DNA进行大幅度的切除，因此会造成遗传信息的缺失。

基因编辑的技术原理可以分为几个步骤：

① “寻找”：基因编辑机器靶向特异性的基因。

② “切开”：基因编辑机器所携带的核酸酶切开靶基因，形成DSBs。

③ “修复”：细胞启动基因修复机制talen技术过程，主要是通过NHEJ和HR进行修复。

▲ZFN、TALEN和CRISPR基因编辑示意图

非同源末端连接（nonhomologous end-joining, NHEJ）介导的修复倾向于磨平断裂位点，通过DNA粘性末端降解或引入额外的碱基最终形成互补配对的平末端，并介导DNA的连接。NHEJ会造成一定数量的插入或缺失突变（Indels）。最终引起蛋白质翻译的提前终止，进而极大的抑制基因功能。

同源定向修复（homology-directed repair, HDR）需要在有同源供体DNA模板存在的情况下，利用配对的DNA作为模板修复断裂，造成位点特异性的基因重组，实现突变基因的校正或插入全新的序列。

▲基因编辑原理及DSBs修复机制

最早期的基因编辑工具。它是通过一种序列特异性的内切酶-归巢内切酶（homing endonuclease, HE）实现对DNA的切割，在特点位置形成双链断裂，从而在染色体中敲除内源基因或敲入外源基因talen技术过程，实现对单基因突变相关疾病的校正。HE具有较大的切割位点，通常为14-25bp。

▲HE基因编辑机制示意图

ZFN是一种人工融合蛋白，其由特异性识别DNA序列结构域的锌指蛋白（ZFP）和非特异性切割DNA双链结构域的Fok I核酸酶。ZFP的结构单元是一种在多种蛋白质中都存在的蛋白基序-锌指（ZF），其介导蛋白质与其它蛋白、核酸或小分子特异性结合。ZF由30个氨基酸残基组成，这些氨基酸残基折叠成α-β-β的二级结构，围绕着中间的锌离子形成独立的四面体结构。每个ZFP可结合3-4bpDNA序列。因此在设计ZFN时只需针对目的基因设计8-10个ZFP，再将这些ZFP与Fok I核酸酶结合，就构成了具有特异性切割功能的ZFN。

▶ 优点：靶向传递基因的效率高，靶向结合效率高。

▶ 缺点：核酸酶设计成功率低；较高的脱靶率；不适合高通量靶向目的基因。

▲ZFN基因编辑机制示意图

TALEN的构造和作用原理与ZFN相似，包括可特异性识别并结合DNA序列的结构域-TALE和非特异性切割结构域-Fok I核酸酶。

TALE蛋白由3部分构成，包括C端序列、N端序列以及一段可特异性识别DNA序列的中间重复序列。C端具有核定位信号和转录激活结构域；N端具有可分泌转运信号的易位结构域；中间的重复序列是DNA结构域。每个重复的单体包含33-35个氨基酸，其中大部分重复氨基酸是高度保守的，但在12 和13号位置上存在两个重复可变残基（repeat variable diresidues，RVDs）,它们参与对DNA双链上碱基的特异性识别。天冬酰胺—组氨酸（ＮＨ）识别Ｇ，天冬酰胺—异亮氨酸（ＮＩ）识别Ａ，天冬酰胺—甘氨酸（ＮＧ）识别Ｔ，组氨酸—天冬氨酸（ＨＤ）识别Ｃ，天冬酰胺—天冬酰胺（ＮＮ）识别Ｇ或Ａ。因此，TALEN在识别目标位点的特异性方面比ZFN更有优势，且构建方式较为简便。

▶ 优点：特异性高，容易设计；靶向结合效率高；核酸酶设计成功率较高。

▶ 缺点：靶向传递效率低；重复序列可能造成非特异性剪切；通量低。

▲TALEN基因编辑机制示意图

目前已经发现了３种类型的CRISPR/Cas系统：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。其中Ⅰ型系统中起切割作用的核心蛋白是Cas3；III型的核心蛋白是Cas10，这两种蛋白的设计都比较复杂。II型系统主要依赖Cas9蛋白的核酸内切酶进行特异性切割，组分较为简单，也是最为常用的一种类型，广泛用于生物体或细菌的基因组编辑。

CRISPR/Cas9系统由具有核酸内切酶性质的Cas9蛋白、具有特异靶向性的CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（Transactivating crRNA，tracrRNA）3种元件组成。当系统作用时，CRISPR序列会转录成非编码的前体crRNA，同时tracrRNA也会被转录合成，前体crRNA在tracrRNA的激活以及Rnase III的作用下形成成熟的crRNA。crRNA与tracrRNA能够通过碱基互补配对原则形成双链RNA，并与Cas9蛋白形成复合物。通过识别目的序列下游3’端存在的一段保守特殊结构-PAM（proto-spacer adjacent motifs）对目的DNA进行靶向特异切割。在工程化改造CRISPR/Cas9的过程中，crRNA- tracrRNA被融合形成一条嵌合的单分子指导RNA（sgRNA），使得该系统个容易进行操作。

▶ 优点：编辑效应更高；操作简单，成本低；高通量。

▶ 缺点：脱靶效应高；同源重组效率低。

▲CRISPR/Cas基因编辑工程化前后对比图

2016年单碱基转换的基因编辑技术（BE）诞生。该技术基于无核酸酶活性的Cas9n（Cas9 nickase）、胞嘧啶脱氨酶、尿嘧啶糖基化酶抑制子（UGI）以及sgRNA形成的复合体，在不引起双链DNA断裂的情况下，直接使靶向位点的胞嘧啶（C）脱氨基形成尿嘧啶（U）；由于尿嘧啶糖基化酶抑制子的存在，抑制了U的清除；随着DNA复制，U逐渐被胸腺嘧啶（T）替代。同时互补链上原来与C互补的鸟嘌呤（G）也被替换成腺嘌呤（A），实现在一定活性窗口内C到T和G到A的单碱基精准编辑。

随着研究者继续对该系统进行了优化，单碱基基因编辑的靶向范围显著提高，脱靶效应减少。到目前为止，该系统单碱基转换效率已达到50%的效率（人类），并且引入插入或缺失的频率低于0.1%。

▶ 优点：脱靶效应低；单碱基精准转换。

▶ 缺点：不能敲除或敲入。

▲BE基因编辑机制示意图

参考资料：

[1] Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III.(2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trendsin Biotechnology, 31(7): 397-405.

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[3] Gupta SK, Shukla P. Gene editing for cell engineering: trends and applications. Crit Rev Biotechnol, 2017, 37 (5): 672-684.

[4] 卢俊南，褚鑫，潘燕平等. 基因编辑技术：进展与挑战.中国科学院院刊. 2018年.第33卷.第11期.

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