dna重组技术的应用 免费领取快手赞 -拼多多助力卡盟 - 免费快手点赞

客服   拼多多砍价dy抖音ks快手 自助商城点击进入

目前市面上广泛应用的胶原蛋白主要来自动物皮，如猪皮、牛皮、鱼皮、鹿皮、驴皮等，动物源胶原蛋白具有价格低廉、制备工艺简单等优势。

但是传统的提取制备方法常导致胶原蛋白结构改变，且不同批次的动物原料有差异，因此生物功效和临床效果不稳定，而且此类胶原蛋白存在排异反应大、病毒隐患（疯牛病）等缺陷。

伴随着基因工程、蛋白质工程、合成生物学等现代生物技术的快速发展，蛋白质的重组表达已经十分普遍。

重组人源化胶原蛋白是指采用重组DNA技术对编码所需胶原蛋白的基因进行遗传操作和修饰，利用质粒或病毒载体将目的基因导入适当的宿主细胞中，表达并翻译成胶原蛋白或类似胶原蛋白的多肽dna重组技术的应用，并经过提取和纯化等步骤制备而成的一类物质。

重组人源化胶原蛋白作为天然动物组织胶原的替代物，因其生物相容性优异、免疫原性低、可加工及生物功效可控等特点具有广泛应用于生物材料和生物医学等领域的潜力。

动物胶原蛋白弊端

动物组织提取的胶原蛋白在应用上存在以下几个问题：

传染风险：动物组织存在动物源疾病的传染危险（如瘟疫、疯牛病、禽流感等）；

排斥反应：虽然胶原蛋白总体上非常安全，但是异种胶原蛋白存在排斥反应，会导致移植部位的发炎，而且由于排斥反应的存在，移植后并不能持续维持治疗效果，需要重复植入或注射。

分子链断裂：胶原蛋白刚性强，加工过程中易引起分子链断裂。

不溶于水：异种来源的胶原蛋白绝大多数是不溶于水的，在加工过程中所用的溶剂很难脱除完全，从而导致细胞毒性。

均一性差：直接提取的胶原蛋白分为弱变性和强变性两类，组分体系复杂，即使是弱变性胶原蛋白也会有微量其他组分存在。

例如Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原经常伴生出现，而强变性胶原蛋白包括短链、长链、双链、片段三股螺旋、全长完整结构的混合物，因此均一性差，临床效果不均一，严重制约了其在生物医药领域的应用。

此外，动物胶原的收集、加工等各个环节也都存在不确定性。

人Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白生物学功效优于动物胶原，但受制于伦理和法律，不能用人体组织提取，并且也存在病毒隐患及赋型加工难等缺陷，因此功效稳定的胶原蛋白的生产，特别是无病毒隐患、分子量均一、性状稳定、生物学相容性好的胶原蛋白的生产呕待解决。

重组人源化胶原蛋白的发展

01、1997年芬兰奥卢大学胶原蛋白研究中心在毕赤酵母中表达出Ⅲ型胶原蛋白。

02、1998年Vaughan等在啤酒酵母中表达出了携带羟基化片段的类人Ⅲ型胶原蛋白。

03、1999年Bruin等分别利用汉森酵母和毕赤酵母作为宿主菌，表达人Ⅰ型胶原蛋白的α1肽链。

04、2000年Myllyharju等使用甲基酵母表达生产准人纤维胶原蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

05、2005年Olsen等在毕赤酵母X-33中成功表达了长度仅为101个氨基酸的小分子量重组人胶原蛋白，高拷贝筛选后发酵获得具有生物活性的人源型胶原，产量为1.47g/L，纯化之后可替代动物来源的胶原蛋白，并应用于疫苗稳定剂中。

06、2006年芬兰胶原蛋白研究中心在毕赤酵母中选择性地分泌表达了去除C端肽的单链重组胶原蛋白片段(9~45kDa)，而具有C端肽的胶原蛋白片段只能形成非分泌形式的三股螺旋结构，从一定程度上阐明了胶原蛋白分泌表达与蛋白质分子量大小的关系，以及三股螺旋构象与C端肽的关系，为以后的研究奠定了很好的理论基础。

此外在转基因烟草、转基因蚕、昆虫细胞中也有报道人胶原蛋白的表达。

2002年，Merle等在烟叶中利用瞬时表达技术共转化人Ⅰ型胶原基因和嵌合的脯氨酸-4-羟化酶(P4H)基因，成功表达了基化的同源三聚体重组胶原蛋白。

Tomita等通过转基因蚕的丝腺分泌表达人Ⅲ型胶原蛋白片段，但是片段长度只有人全长胶原蛋白的1/5，含量也仅占蚕茧干重的1%左右。

为了解决蚕丝腺中脯氨酸-4-羟化酶活力偏低导致脯氨酸不能被充分基化的问题，Adachi等采用多基因共表达技术，通过胶原蛋白和高活力P4H的共表达，在一定程度上解决了以上问题。

Nokelainen等构建两株杆状病毒表达系统，分别编码人人Ⅰ型原胶原α链和人脯氨酸-4-羟化酶的α和β亚基，共感染昆虫细胞后，成功表达了具有稳定三股螺旋结构的人胶原蛋白，表达量为50mg/L。

虽然很多实验室已经可以成功制备重组人源化胶原蛋白，但是表达量很低，难以实现工业化生产，主要是因为胶原蛋白在生产中会遇到很多的技术挑战。

例如由于胶原蛋白特征序列“Gly-X-Y”的高度重复，可能会为互补的GGN和CCN密码子序列提供潜在的干扰修饰;另外大肠杆菌/酵母等作为宿主菌，由于先天缺乏胶原蛋白翻译后修饰中发挥重要作用的脯氨酸-4-羟化酶，从而影响重组胶原蛋白的生物学功效。

而昆虫细胞、转基因烟叶、转基因蚕等表达体系虽翻译后修饰相对完善，但成本及技术要求非常高，不适合大规模生产。

重组Ⅲ型人源化胶原蛋白

经过多年的研究，采用基因工程技术、发酵工程技术、蛋白质分离纯化技术、生物医学工程的有机结合dna重组技术的应用，开发了基因工程技术生产系列重组胶原蛋白的方法，建立了重组胶原蛋白高效表达体系、高密度发酵工艺及工程控制策略、高效分离纯化方法和产业化技术路线。

重组Ⅲ型人源化胶原蛋白，是由DNA重组技术制备的人胶原蛋白特定型别基因编码的全长或部分氨基酸序列片段 ，或是含人胶原蛋白功能片段的组合。

重组人源化胶原蛋白并不是从人体提取，而是依据人Ⅲ型胶原蛋白的氨基酸序列通过基因重组、生物发酵技术制备的。

其氨基酸序列与人体Ⅲ型胶原蛋白对应片段100%相同，且拥有精确稳定的三螺旋结构。结构决定功能，所以，具有正确的三螺旋结构的胶原蛋白才能完全发挥其生物学活性，提高创面多种细胞再生能力。

重组Ⅲ型人源化胶原蛋白与人体自身胶原蛋白对应片段100%相同，其细胞黏附性为人体自身胶原蛋白的1.83倍。相比动物源性胶原蛋白，其过敏风险低，无动物源病原体污染风险，不添加交联剂，安全系数高。

以往的研究证明了该类材料不但具有无病毒隐患、低免疫原性及更好促进细胞生长代谢繁殖及生物相容性等特性，还具有促黏膜修复和止血等功能潜在应用前景广阔。