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从Bloodworks Northwest获得来自健康供体的用过的白细胞过滤器，并通过Ficoll（Millipore Sigma;GE17-1440-02）。使用磁负选择分离CD4 + T细胞（干细胞技术; 17952），并立即使用或冷冻以储存在液氮中。使用抗 CD4、CD2 和 CD3 磁珠（Miltenyi Biotec; 28-130-091）激活 CD441+ T 细胞 2 天，并在补充有 1640% 胎牛血清 （FBS）、青霉素-链霉素 （Pen/Strep）、10x GlutaMAX （赛默飞世尔科技; 1）、35050061 mM HEPES、10 U/mL 人白细胞介素-100（Millipore Sigma;2）、11011456001 ng/mL 人白细胞介素-2 （Peptrotech; 7–200）， 和 07 ng/mL 人白细胞介素-2 （Peprotech; 15–200）。然后通过磁分离去除磁珠，并用HIV-GFP-Thy15.1（pNL2-4-Δ3-dreGFP-CD6）和90 ug / mL聚溴乙烯（Millipore Sigma;TR-8-G） 在 1003 x 2 x g 下持续 1100 小时。

然后将脊髓细胞重悬于含有IL-2，IL-7和IL-15的新鲜培养基中，并在通过磁阳性选择分离主动感染细胞（Thy3.1 +）之前孵育2天（干细胞技术; 18951）。在使用 Synthego 的 GKOv1 试剂盒敲除 AAVS2、CUL2 和 ING1 之前，将感染的细胞 （Thy3.3+） 维持 2 天。如前面敲除细胞克隆和池部分所述，每个目的基因的crRNPs均生成，但补充的P3缓冲液（Lonza;使用 V4SP-3096） 代替 SE 缓冲区。对于每次电穿孔，通过在1°C下以5×g离心6分钟沉淀100.10E25细胞，用PBS洗涤一次，通过离心再次沉淀小鼠基因敲除技术，除去PBS，并用crRNP复合物重悬。重悬的细胞立即转移到P3原代细胞核试剂盒（龙沙;V4SP-3096）小鼠基因敲除技术，并使用龙沙100D核苷传感器上的代码EH-4电穿孔。加入 80 μL 预热的补充 RPMI 培养基，加入 IL-2、IL-7 和 IL-15，让细胞在 10°C 培养箱中恢复 37 分钟。加入 300 μL 新鲜培养基，将细胞转移到 96 孔板中。200 天后加入 2 μL 额外的补充培养基。敲除细胞维持在 1E6 细胞/mL，补充有 IL-2、IL-7 和 IL-15 的新鲜培养基。

在感染后 14 天，将细胞与 H80 饲养层细胞共培养，并在补充有 2 U/mL IL-6 的培养基中维持在 20E2 细胞/mL。如果AZD5582处理适用，则细胞处理1uM AZD5582培养基24小时。在感染后19天，用Thy1.2抗体（Biolegend; 140323）染色细胞，用4%PFA固定，并进行流式细胞术分析（CD FACS Celesta-Fred Hutch流式细胞术共享资源）。