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操作方法

一、成纤维细胞培养实验

原理

包括人在内的各种成纤维细胞都很容易培养，也是其它组织培养时的副产物，极易获得。人的成纤维细胞不仅容易培养，而且生物性状稳定，很难发生转化，成为二倍体细胞培养的主要对象，人的二倍体细胞系，主要为成纤维细胞。

材料与仪器

细胞

胰蛋白酶

剪刀

步骤

为获取大量成纤维细胞培养，以便冻存，用人或动物胚体为好；动物可用小鼠或鸡胚，去头和内脏，剪成小碎块后，用胰蛋白酶消化法培养；如为人胚，可取皮肤培养。幼儿包皮是培养成纤维细胞的很好对象。

二、巨噬细胞培养实验

原理

巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。但属不繁殖型细胞群，难以长期生存，好的条件下仅能生活2~3周，因之多用作初代培养。巨噬细胞也能建成无限细胞系；大多来自小鼠，如P388D-1、J774A.1、RAW309、Cr.1等，均已获恶性。培养中的巨噬细胞仍保留着原有形态特点和吞噬异物功能，并易于传代和从培养瓶壁分离，但却难以建立成为传代细胞系。

材料与仪器

Eagle肝素血清

解剖台蜡板镊子解剖剪注射器针头离心管吸管培养瓶细胞计数器

步骤

培养巨噬细胞可用各种方法和各种来源获取细胞，其中以小鼠腹腔取材法最为实用。人的材料除来源不同外，培养方法大同小异。

1.实验前三天，向每只小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤1 ml（勿注入肠内）；

2.引颈杀死动物；手提鼠尾将全鼠浸入70%酒精中3~5秒；

3.置动物于解剖台上，用针头固定四肢，双手持镊撕开皮肤拉向两侧，暴露出腹膜，但勿伤及腹膜壁；

4.再用70%酒精擦洗腹膜壁后，用注射器吸10 ml Eagle液注入腹腔中，同时从两侧用手指揉压腹膜壁，令液体在腹腔内充分流动；

5.用针头轻轻挑起腹壁，使动物体微倾向一侧，使腹腔中液体集于针头下吸取入针管内；

6.小心拔出针头，把液体注入离心管中，250 g（4℃）离心10分钟后，去上清，加10 ml Eagle培养基；

7.计数细胞，每只小鼠可产生20~30×106细胞，其中90%为巨噬细胞；

8.为获取3×105个贴附细胞/平方厘米，需接种2.5×106/ml；

9.为纯化培养细胞，去除其它白细胞，接种数小时后，去除培养液，用Eagle液冲洗1~2次后，再加新Eagle培养液置37℃CO2温箱中培养。

常见问题

一、培养技术要点

1.来源和取材

巨噬细胞可来源于人胸水、腹水、血和透析液等材料。实验多从动物血液、肺、脾和胸腹腔获取，其中以从动物腹腔取材最常用。在不加任何刺激物自然情况下，一个小鼠腹腔中，就含有2~3×106个细胞，而且大多无炎症反应，冲先出来即可用于培养。如欲获取多量巨噬细胞，可于取材3~5天前，向动物腹腔中注射刺激物，便能获得大量细胞。刺激物种类很多，如牛血清、矿物油、硫羟乙酸盐肉汤等，均能刺激产生大量巨噬细胞；缺点是很多刺激物能激活吞唾细胞并被其吞噬，进行培养以后，刺激物常不能很快被消化掉，残留在细胞内，能干扰细胞代谢。用40μg的PHA注入腹腔中，能产生6~8×106个细胞，而且无刺激性，效果较好。从500 ml血中能获取108个单核细胞组织和细胞培养技术，但易杂以血小板及其它白细胞，尚需做进一步的分离和纯化。

2.纯化和分离

从各种来源和用各种方法所获的巨噬细胞群中，多混有其它细胞成分，如淋巴细胞、中性细胞、血小板和成纤维细胞等，应把它们分离出去。附着分离法比较实用，原理是借用大多数单核巨噬细胞有极易附着于玻璃表面的特性，在先把细胞群置于玻璃培养容器中数小时后，巨噬细胞能最先附着于玻璃表面，此时再用培养液或PBS冲洗掉尚未附着的中性粒细胞和激活的T淋巴细胞等，剩余巨噬细胞纯度可达95%。如中性粒细胞也附着，可继续延长时间至24小时，此时大多数巨噬细胞都已附着于瓶壁，而中性粒细胞可变性死亡。继之再从瓶壁上把巨噬细胞分离下来进行培养，便获得纯净巨噬细胞。

巨噬细胞对胰蛋白酶和EDTA均不敏感，不易使之离壁，必要时可用胶刮刮除，但可能损伤细胞。用不加防腐剂的纯利多卡因处理（干液为PBS配的360 mM液，用1 N NaOH调节pH值到6.6，同时稀释成12 mM浓度）组织和细胞培养技术，加入培养基中，37℃作用5分钟，可使巨噬细胞变圆，此时稍加吹打，即可使细胞分离。注意要控制好作用的时间，以免细胞丢失。

3.培养条件

据实验目的不同，可选用各种培养基：如199（加新鲜谷氨酰胺加青链霉素）；NCTC-135；RPMI 1640；Ham12等均适于巨噬细胞培养。大多数巨噬细胞培养可加10%~40%的血清，小鼠巨噬细胞加10%小牛血清，用无血清培养基亦可。新生小牛血清中含有抗体，能刺激巨噬细胞成熟。也可用乳清蛋白培养。巨噬细胞适于CO2温箱培养，pH7.2，细胞接种密度以2~4×105/cm2为宜。

4.生物性状和鉴别

培养中的巨噬细胞在很多方面与淋巴细胞或其它白细胞相似，应严加区别。正常巨噬细胞能附着瓶壁，胞质延展，细胞大小介于10~50微米之间，胞核呈特有的肾形，胞质有皱褶，细胞群多时能连接成单层；有时细胞呈多角形并连接成网状。巨噬细胞对胰蛋白酶有抵抗性，借此可下其它细胞相区别，也是淘汰其它细胞的方法。单核巨噬细胞胞质中含有丰富的非特异性脂酶，并具有C3b和FC表面受体。巨噬细胞对培养环境敏感，很易发生与在体内时很大不同的改变；有强烈的吞噬活动。如向培养环境中加入淀粉粒、乳胶粒、红细胞及调理素（或新鲜血清、特异抗体）等，可见巨噬细胞能吞噬五个以上的颗粒。

细胞状态不良时，胞质常不延展，胞体变圆，不透明，或脱离瓶壁飘浮在培养液中和失去吞噬能力。